|
PresentationsComputer simulation of an experiment to study the interaction between the Cas9-sgRNA complex with DNA via fluorescence microscopySirius University of Science and Technology, 354340, Olympic Ave, 1, Sochi, Russia 1Lomonosov Moscow State University, 119991, Lenin Hills, 1, 73, Moscow, Russia Рибонуклеопротеиновый комплекс белка Cas9 с sgRNA, который способен связывать и расщеплять ДНК в определенных локусах, комплементарных участку последовательности sgRNA, занимает центральное место в революционной технологии редактирования генома CRISPR/Cas. Следовательно, эффективный in vitro анализ для характеристики сродства связывания рибонуклеопротеинового Cas комплекса с целевой последовательностью ДНК-мишени имеет большое методологическое значение. Эффективный способ измерения сродства биомолекулярного комплекса может быть основан на использовании FRET-микроскопии путем детекциии увеличения сигнала FRET. В этой работе с помощью молекулярного моделирования мы показываем, что такие измерения возможны для изучения связывания комплекса Cas9-sgRNA с целевой последовательностью ДНК путем присоединения флуоресцентных меток Cy3 и Cy5 к определенным сайтам на молекулах ДНК и РНК. Чтобы учесть гибкость линкеров между флуоресцентными метками и ДНК, мы провели моделирование с помощью молекулярной динамики меток Cy3 и Cy5, прикрепленных к короткой дцДНК, моделирование проводилось в Gromacs. Моделирование проводилось в течение 10 нс. Положения центров масс хромофорных групп по отношению к меченому тимидиновому нуклеотиду были получены из каждого кадра. Таким образом был получен ансамбль потенциальных положений Cy3 и Cy5 по отношению к их сайтам прикрепления на ДНК. Чтобы найти оптимальные положения для позиционирования меток, мы наложили полученные ансамбли потенциальных положений Cy3 и Cy5 на петлю sgRNA (tetraloop sgRNA) (нуклеотиды 24-48), целевую (цепь, на которой расположен участок, комплементарный участку sgRNA) цепь ДНК (нуклеотиды 1-18) и нецелевую цепь ДНК (нуклеотиды 41-56) Cas9 комплекса (PDB ID 5Y36). Мы обнаружили, что наиболее оптимальными положениями для флуоресцентных меток являются 37 на sgRNA, 11 на целевой цепи ДНК и 49 на нецелевой цепи ДНК. Данные положения соответствуют коротким расстояниям между метками равному около 20 Å, что приведет к очень высокой эффективности FRET. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-34-51053.
Presentation |
